脑积水是脑脊液(CSF)的病理性积聚，导致脑室肿大。脑积水可原发或继发于外伤性脑损伤、感染或颅内出血。不管是什么原因，目前的治疗方法都是通过手术排出多余的脑脊液。重要的是，没有长期有效的药物治疗，这代表了临床未满足的需求。许多形式的脑积水涉及水和电解质稳态失调，使其成为一个有吸引力的药物靶点。

　　在体外，采用电生理和流体通量相结合的方法来阐明脉络膜丛上皮细胞培养模型中分泌的上皮电解质和流体通量，并确定血清糖皮质激素诱导的激酶1 (SGK1)的参与。在体内，在脑积水遗传大鼠模型中进行了MRI研究，以确定新型抑制剂SI113对SGK1的抑制作用。

　　在培养的细胞系中，SI113减少了经上皮电解质的分泌和液体通量。在体内，SI113阻断脑积水的发展，对野生型动物的心室大小没有影响，也没有明显的毒性作用。在机制上，大鼠脑积水模型的发展涉及激活磷酸化SGK1的增加，而SGK1的总量没有变化。SI113抑制磷酸化，脉络膜丛上皮中总SGK1水平无变化。

　　这些数据为使用SGK1抑制剂治疗脑积水提供了强有力的临床前基础。

　　脑脊液(CSF)包裹着大脑，起到缓冲作用，有效减轻体重。此外，这种独特的液体提供营养和激素支持，有助于清除废物，并使信号分子和免疫细胞循环[1]。有趣的是，脑脊液的量和组成是昼夜调节的，可能参与睡眠/觉醒周期的控制，这强调了脑脊液调节对正常生理功能的重要性[2]。

　　在人类中，脑脊液的产生和重吸收速度约为500 mL/天[1]。这种重要的液体在被重新吸收之前流经脑室系统和中央管道。在过去的几十年里，关于在没有中枢神经系统实质淋巴系统的情况下如何回收这种数量的脑脊液的观点不断发展。在旧的“教科书版本”中，脑脊液吸收被设想为通过蛛网膜绒毛或颗粒发生[3]。最近，文献中有一些共识认为筛状板下嗅觉粘膜下层的淋巴管[4]和最近阐明的脑膜-硬膜窦[5]在这一过程中起主要作用。prooulx对这一主题进行了极好的历史回顾[6]。在创伤性脑损伤、脑积水、中风或对年龄相关疾病知之甚少的情况下，产生和吸收之间的平衡可能会失调[7,8]。在脑积水中，脑脊液流动中断或生产和重吸收之间的不匹配导致脑脊液积聚，可损害脑结构。如果不及时治疗，脑积水可导致认知障碍、发育迟缓、脑损伤、步态不稳定、视力丧失、睡眠障碍和死亡[8,9,10]。

　　目前脑积水的标准治疗是建立脑脊液引流通道，通过放置物理装置(分流器)或建立新的通道(内镜下第三脑室造瘘术)[8,10,11,12,13]。虽然分流器放置是最常见的干预形式，但它会带来包括感染、堵塞和机械故障在内的并发症，大约50%的儿童分流器在两年内需要进行修复手术[11,12]。虽然第三脑室内窥镜手术在一个亚组患者中是成功的，但由于脑积水的病因，很少有患者符合该手术的条件[13]。因此，持久有效的药物治疗脑积水是必要的，并将为脑积水患者提供非侵入性的长期选择。

　　脉络膜丛(CP)产生大部分脑脊液，由一个被屏障上皮包围的开孔毛细血管网组成，形成血-脑脊液屏障[1,14,15]。脉络膜丛上皮细胞(choroid plexus epithelial cells, CPe)通过调节多种CPe转运体和通道，负责脑脊液的分泌和独特组成[1,15,16,17,18]。虽然通道和转运体的特性很好地表征了，但对这些实体的调节却知之甚少。其中两个通道，即非特异性阳离子通道，瞬时受体电位香草素4 (TRPV4)和钠钾2氯通道1 (NKCC1)，最近被认为与脑积水的病理生理有关[19,20,21]。我们的研究小组之前已经表明，TRPV4在原生脉络膜丛和两种脉络膜丛衍生的连续细胞系中都有表达，并且是CPe的主要调控枢纽通道[22,23,24,25]。TRPV4响应多种刺激，包括渗透压、温度、机械应力和炎症的变化[26,27]。目前的研究强调了TRPV4通路中的一个新的药物靶点，血清和糖皮质激素诱导的激酶1 (SGK1)，并显示了SGK1抑制剂在体内治疗脑积水和体外治疗人类细胞系的机制上的有效性。

　　SGK1首先在乳腺肿瘤细胞系中被发现[28]，随后被发现可被一系列刺激激活，包括激素、血清和细胞体积变化[29,30,31]。早期研究认为SGK1是类固醇激素和肽激素刺激肾上皮钠通道的汇聚点[32]。随后的研究表明，该激酶是调节多个组织中多种通道和转运体的重要信号传导介质[31]。最近，SGK1参与了致癌转化[33,34,35,36,37]。SGK1作为细胞应激过程中诱导的关键激酶[30,31]，在呼吸机诱导的肺损伤过程中与应激诱导通道TRPV4相关[38]，在培养细胞中，TRPV4是SGK1的底物[39]，SGK1的磷酸化是肌动蛋白结合所必需的[40]。在转染细胞的研究中，SGK1的磷酸化被证明可以促进TRPV4的单通道活性、Ca2+内流、蛋白质稳定性和细胞膜的扩张[40]。TRPV4和SGK1之间的相互作用很可能最终被证明是许多细胞功能的重要组成部分。

　　SI113是一种小分子量的膜渗透化合物，是sgk1介导途径的抑制剂[33]。在针对肝癌、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌和结肠癌细胞的各种临床前研究中，SI113被研究为一种潜在的化疗药物[34,35,36,37]。这些体外和体内研究表明，SI113在抑制人造肽底物SGK1磷酸化以及参与致癌转化的已知内源性蛋白靶点方面具有高特异性，包括MDM2(小鼠双分钟2同源物- E3泛素蛋白连接酶)和NDRG1 (n-myc下游调节的1-a应激反应蛋白)[33,34,35,36,37]。重要的是，体外实验显示SGK1对AKT1 (rac - α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，或蛋白激酶B)的抑制特异性，AKT1磷酸化蛋白质中相同的靶序列，以及对密切相关的激酶(如Abl和Src)的特异性[33,34]。在小鼠体内的研究表明，通过体重减轻、腹泻、皮炎、溃疡或肝功能衰竭的迹象来评估，该药物没有短期毒性[35]。

　　目前的研究证实了SI113在上皮细胞中的特异性，表明它抑制肾集管细胞中醛固酮敏感的钠重吸收，这一途径已知是由SGK1信号轴介导的[32,41,42,43]。在人脉络膜丛上皮模型中[25,44]，HIBCPP系，SI113抑制trpv4介导的上皮离子通量和伴随的电导变化。在出生后脑积水的遗传大鼠模型中[45]，SI113通过调节受病动物脉络膜丛中SGK1的活性，显著地阻止了受病动物脑室肥大的进展。综上所述，本项目为考虑将SI113作为多种原因导致的脑积水的治疗方式提供了有希望的临床前基础，并为脑积水患者提供了一种无创、持久的护理标准。

　　小鼠皮质收集管(mCCDcl1)细胞在含有4.5 g/L葡萄糖、22 mM碳酸氢盐、4%胎牛血清、100 U/L青霉素、100 mg/L链霉素、1%胰岛素-转铁蛋白-硒酸盐100X (Sigma #I3146)、地塞米松(50 nM)、EGF (10 ng/mL)和三碘甲状腺原氨酸(1 nM)的DMEM:F12中培养。mCCDcl1细胞在75 cm2的瓶中培养至100%融合，然后在聚碳酸酯可渗透载体(Millicell #PIHP03050)上以100%融合密度传代和播种。培养物在全培养基上过滤培养8 d，然后在无血清培养基上培养48 h，再在无血清和无激素培养基上培养48 h。

　　HIBCPP细胞在含有4.5 g/L葡萄糖、44 mM碳酸氢盐、10%胎牛血清、100U/L青霉素、100mg /L链霉素和5 μg/L胰岛素(Gibco, human recombinant)的DMEM中培养。HIBCPP细胞在25 cm2的烧瓶中培养至90%的融合度，然后在Millicell渗透性载体上以75%的融合密度传代和播种。HIBCPP细胞在前7天每隔一天更换培养基，然后在第7 - 10天每天更换培养基。第10-16天，在细胞顶端(上)表面饲喂无血清DMEM培养基，在底外侧(下)表面饲喂全培养基，模拟体内条件。

　　HIBCPP细胞在6个孔板的Millicell渗透性支架上生长。按照制造商的建议，细胞在顶部(顶端表面)和底部(基底外侧)分别添加1.5 ml培养基和2 ml培养基;面对6孔板)，以避免任何跨细胞的压力差。将细胞培养14-16天形成融合的高抗性单层培养物，如Hulme等人先前所述[25]。在实验方案中，使用精确的Pipetman将根尖和基底外侧媒质完全去除，并在顶腔和底腔中置换。在根尖室中加入化合物或稀洗液(0.1%或0.2%)，覆盖6个孔培养板，水平旋转混合后放回培养箱中10分钟。将根尖培养基完全去除，放入预称重的收集管中。然后对含有培养基的试管重新称重，并根据培养基的密度(0.9874 g/mL)计算出产液。称重管的研究者不知道每根管的介质处理情况。

　　mCCDcl1细胞在30 mm聚碳酸酯滤池上培养12天，HIBCPP细胞在相同滤池上培养16天。滤光片切除，安装在使用室中，与盐琼脂电压和电流电极组装，并连接到World Precision Instruments DVC-1000电压/电流钳。细胞浸泡在温度控制的无血清培养基中，用5% CO2/O2气举充氧。测量自发的上皮电位差并将其箝位到零，从而测量净上皮离子通量，即短路电流(ISC)。ISC阳性表明阴离子分泌或阳离子吸收;负偏转表示相反。通过施加2mv脉冲并通过欧姆定律计算电阻，每200s计算一次屏障密封性指标上皮电阻(TEER)。电导计算为TEER的倒数。每个面板中显示的图表代表了一系列平行生长和分析的对照和实验培养物(技术重复)。我们实验室通常的做法是绘制每种药物在每种细胞系中的剂量-反应曲线，并选择产生最大反应的最低剂量。这样做是为了尽量减少脱靶效应。

　　野生型、杂合型和纯合型(Tmem67P394L)幼崽通过杂合成虫配对产生。本研究采用先前描述的基因分型方案对动物进行基因分型[20]。随机选择正常和脑积水(Tmem67P394L)幼崽进行药物或载体治疗。只有在最后一次MRI检查前动物死亡才被排除。

　　将正常和脑积水动物随机分为药物组和载药组。在出生后第7天(治疗前)和第15天(治疗后)对所有幼犬进行核磁共振成像。在核磁共振成像的间隔时间内，出生后第7-14天，幼崽每天腹腔注射SI113 (8 mg/kg BW)或等量的载体(DMSO)。在出生后第15天完成处理后MRI后，处死动物并收集组织。处理方案和组织选择示意图如图3A所示。

　　如Hochstetler和Smith等人[20]所述，在P7和P15，将大鼠幼仔短暂地从产仔中取出，并用1-3%异氟烷(平衡医用氧)麻醉。采用配备专用4通道大鼠头线圈和床系统(RapidMR)的3t Siemens Prisma临床MRI扫描仪获得高分辨率t2加权(T2W) MRI图像。使用SPACE3D序列获取图像，获取参数如下:(TA:，5.5 min;TR, 2080 ms;TE, 162毫秒;ETL、57;FS,;大街,2;激励翻转角，150;范数滤波，开;恢复磁化，On;切片厚度，0.2 mm;基体，171 × 192;视场，35 × 35 mm)产生0.18 × 0.18 × 0.2 mm分辨率的图像。侧脑室的体积由原始脑脊液对比的强度归一化和基于阈值的图像分割确定。使用Analyze 12.0 (Analyze Direct, Stillwell KS)对侧室容积图像进行量化。在所有病例中，研究人员在获取和分析过程中对基因型和治疗方法不知情。

　　动物通过二氧化碳暴露和斩首安乐死。解剖脑组织，取出侧脑室cp，用液氮快速冷冻。CP RNA采用Monarch Total RNA Miniprep Kit (New England Biolabs, T2010S)分离。采用ND2000 NanoDrop (Thermo Fisher Scientific)检测RNA浓度(μg/μl)和质量(A260/280 > 2.0和A260/230 > 1.8)。根据制造商的说明，使用Monarch Lunascript RT SuperMix Kit (New England Biolabs, E3010L)，以及相应的阴性RT (-RT) cDNA对照和无RNA模板对照(NTC)，将总RNA逆转录为cDNA。利用Ensembl在线数据库(ensembl.org)获取褐家鼠各基因外显子mRNA序列，利用Primer3Plus (primer3plus.com)设计引物对;表1).模板cDNA与正向和反向引物(IDT)以及AccuStart II GelTrack PCR SuperMix (Quantabio, 95136)结合。反应在温度梯度下进行，以确定每个引物对的最佳退火温度，产物在2% TAE琼脂糖凝胶上分离，使用SYBR安全DNA凝胶染色(Invitrogen, S33102)。侧翼100 bp和50 bp梯架(New England Biolabs Inc.， #B7025;#B7025)作为分子量标记，使用紫外凝胶成形仪对凝胶进行成像。每个目标基因的RT-PCR反应产物用ExoSAP-IT Express (Applied Biosystems, 75001)纯化，送去测序(Eton Biosciences)，正确的产物使用NCBI BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)进行验证，并确认与适当目标的一致性百分比。

　　表1 RT-PCR和qRT-PCR的引物对

　　收集每只动物的CP RNA并按照RT-PCR的描述进行转录。cDNA用无核酸酶水稀释(New England Biolabs)。1:10的标准曲线,1:10 0,1:1000,1:1稀释cDNA是用来确定的线性愤怒qPCR使用底漆对描述分析。所有样品一式三份。qPCR采用LightCycler 480 Instrument II实时PCR系统(Roche LifeScience)，使用LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix (Roche LifeScience, 04707516001)。qPCR循环条件为95°C 5 min，依次为95°C 10 s、60°C 10 s、72°C 10 s 45个循环。使用2 -ΔΔCT方法将数据显示为相对于校准参考基因GAPDH和RPS18的表达变化倍数。数据显示为相对于归一化对照(未经处理的正常动物)的倍数变化。

　　侧脑室CP样品或细胞裂解液样品在冰上收集，在冰冷的RIPA缓冲液(Millipore # 20-188) + 1% HALT抑制剂鸡尾酒(Invitrogen)中裂解15分钟，人工匀浆，25000 × g离心15分钟。样品的上清部分加入4 × Laemelli样品缓冲液(0.2 M Tris-HCl, 0.4 M二硫索糖醇，277 mM SDS, 6 mM溴酚蓝，4.3 M甘油)，在70°C下变性10 min。将样品装在4 - 15% Bio-Rad Gradient TGX stainfree凝胶上分离。分离后，使用Bio-Rad Trans-Blotter系统在半干燥条件下1.0A将蛋白质转移到硝化纤维素膜上30分钟。膜用总蛋白染色(Ponceau-S)染色，成像，然后在阻断缓冲液(5%牛奶在Tris缓冲盐水中)中孵育。将膜与一抗(表2)在阻断缓冲液中稀释，在4℃下孵育过夜。用阻断缓冲液在室温下洗涤膜30分钟，然后用阻断缓冲液稀释的二抗(Jackson ImmunoLabs驴抗兔AlexaFluor 790)室温孵育1小时。膜暴露在LICOR Odyssey成像站上，以观察抗体结合的荧光信号。波段强度分析在LICOR Odyssey软件中完成。如图图例所示，所示的印迹是每个基因型/处理条件的技术重复和生物重复的代表。条带强度归一化为Ponceau，通过ImageJ像素强度量化每车道测量总蛋白质负载。对于p-SGK1和SGK1，条带被归一化为总蛋白负载，然后用p-SGK1与总SGK1的比值表示。

　　表2免疫印迹所用抗体

　　在GraphPad Prism 8.0中对数据进行制图和分析。对于电生理示踪，使用重复测量方差分析(RM-ANOVA)来确定两个示踪随时间的差异，并结合多重t检验行分析。非球面数据采用温室-盖瑟修正。对于以柱状图表示的数据，根据数据的复杂程度，使用方差分析或t检验比较组均值。对于非参数t检验，采用Wilcoxon-Mann-Whitney事后分析。非参数方差分析采用Kruskall-Wallis检验。对于所有的分析，p < 0.05被认为是显著的。

　　这些研究中使用的脑积水模型为Tmem67P394L大鼠[20,45,46,47]。动物实验是根据印第安纳大学普渡大学印第安纳波利斯分校机构动物护理和使用委员会批准的方案完成的。

　　摘要

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　　为了测试SI113对SGK1的特异性，我们使用了小鼠皮质收集管细胞系mCCDcl1。SGK1在控制肾元醛固酮敏感段ENaC活性的细胞内通路中的作用已被很好地描述[32,41,42,43]。使用电生理技术测量电致上皮离子通量，我们证明mCCDcl1细胞确实对醛固酮敏感，在基底外侧添加10 nM醛固酮后，ISC在基础水平上增加，与我们和其他小组先前在这些细胞中报道的结果相当(图1A，黑色痕迹;图1B，黑色圆圈)。2小时后，在培养物中加入低剂量的阿米洛利，以消除上皮钠通道(ENaC)介导的钠通量。由于大多数基础电流和醛固酮感应电流对阿米洛利敏感，我们可以得出结论，我们实验中测量的电通量与醋酸钠介导的钠吸收相对应。在醛固酮之前添加SI113 (20 μ m双侧)(图1A，粉红色痕迹)抑制醛固酮引起的钠转运增加。这些数据令人信服地表明SI113抑制SGK1活性。作为SGK1活性的额外测量，我们评估了SGK1的已知下游靶标p-NDRG1的丰度。先前对这些细胞的研究表明，商业SGK1抑制剂降低了p-NDRG1的丰度[42]。在我们的细胞中，我们也看到醛固酮处理的细胞裂解物中p-NDRG1丰度的增加(图1C，粉色圆圈)，与SGK1活性的增加一致。用SI113处理后，p-NDRG1丰度降低(图1C，蓝绿色圆圈)。从这些实验中，结合文献对其特异性的研究[33,34,35,36,37]，我们得出结论，SI113是SGK1激酶活性的特异性抑制剂。

　　图1

　　

　　SI113阻断醛固酮刺激的enact介导的钠吸收增加，并降低小鼠皮质集管(mCCDcl1)细胞系中SGK1的活性。A中的示踪说明了平均短路电流，ISC，即在可透性支架上生长的mCCDcl1细胞的融合单层上的净透上皮吸收钠通量的测量，如图所示为若干次重复n。将培养物安装在Ussing室中，测量单层间的自发电位差并夹紧至零。生成的ISC。是时间的函数。在t=?10 min时，将10 nM醛固酮递送至基侧孵育所有培养物。在t=0 min时，用20μM SI113双侧孵育实验培养物。在时间t=120 min时，加入1μM amiloride，一种特异性上皮钠通道抑制剂ENaC，以指示净钠通量引起的ISC量。B表示对照和实验培养ISC的基线变化。C显示了p-NDRG1在载体处理(DMSO)、醛固酮处理(2小时孵育)或SI113 +醛固酮处理的细胞裂解物中的代表性免疫印迹(n=3个生物重复，技术重复)。柱状图显示了细胞裂解物中p-NDRG1相对于总蛋白的相对丰度。所有图表中的数据均以平均值±sem表示。短路电流;N=重复数;Aldo=醛固酮;si=si113;p-NDRG1=N-Myc下游调控

　　为了表征SGK1在脉络膜丛上皮细胞中的作用，我们使用了一种人类CPe连续细胞系，该细胞系已在我们的实验室中被验证和鉴定为中等抗性细胞系，具有关键转运蛋白的正确极化，并保持了天然组织的几个特征[25,44]。在该细胞系中，TRPV4刺激了经上皮电解质通量的多模态增加以及经上皮通透性的大幅增加[25]。在其他组织中，SGK1已被证明磷酸化并激活膜上的TRPV4通道，从而作为TRPV4的上游调节激酶[39,40]。在人脉络膜丛上皮细胞系中，我们发现SI113预处理对基底上皮离子通量没有影响，但阻断了正常trpv4刺激的多相离子通量和电导增加(图2A, B，粉红色痕迹)。有趣的是，在TRPV4激动剂刺激后5分钟添加SI113也中断了正在进行的反应，并使细胞恢复到基线离子运输和电导(图2A, B，蓝绿色痕迹)。这种治疗后反应类似于TRPV4拮抗剂逆转TRPV4反应[25]。因此，本实验提示SGK1和TRPV4在脉络膜丛上皮细胞中存在功能联系，SGK1是脉络膜丛上皮细胞中重要的调节激酶。我们之前也已经证实，TRPV4在这些细胞中的激活会导致液体产生的增加[25]，在这里，SI113预处理抑制了TRPV4激动剂诱导的液体产生(图2C)。

　　图2

　　

　　SI113阻断trpv4介导的人脉络丛细胞系(HIBCPP)上皮离子通量和电导变化。短路电流(ISC)是衡量净上皮电致离子通量的指标;电导是上皮电阻的倒数，是上皮通透性的量度。HIBCPP融合单层被安装在Ussing室中，并允许达到稳定的基线。在t=?5 min时，用25μM SI113双侧孵育实验培养物，在t=0 min时，所有培养物顶部接受10 nM GSK，以刺激上皮离子运输。SI 113预处理(粉色示踪)显著抑制trpv4介导的上皮离子通量A的变化，完全抑制trpv4介导的电导B的增加(黑色示踪=对照)。在t=5分钟(绿线)加入SI 113处理后，逆转了正在进行的trpv4介导的运输和传导。C用DMSO(对照)、GSK (15 nM)或SI + GSK (25 μM SI113)培养15分钟产生的液体，以每平方厘米微升为单位。n=5 DMSO和n=7 GSK数据点复制自Hulme等人[22]。所有图表中的数据均以平均值±sem表示。N=重复数;Ns=不显著;GSK=GSK1016790A, TRPV4激动剂HIBCPP=人脉络丛乳头状瘤细胞系

　　为了研究SI113对脑积水的影响，我们采用遗传大鼠模型Tmem67P394L;(也被称为Wpk，即“患有多囊肾病”)。该模型与一种称为Meckel-Gruber综合征3型的人类遗传疾病同源[45,46,47]。受影响的动物在Tmem67的第12外显子中携带单个C到T的替换，该替换将蛋白质产物(P394L)中的脯氨酸转化为亮氨酸，该产物编码一种参与初级纤毛形成的蛋白质复合物。纯合子感染的动物有严重的脑积水和肾囊性疾病，通常在出生后存活18-21天。重要的是，我们在该模型中发现，使用两种结构不同的TRPV4拮抗剂治疗可抑制脑积水的进展[20]。

　　由于SGK1和TRPV4似乎在脉络膜丛上皮中存在功能联系，我们试图在遗传大鼠模型中测试SI113是否也能有效抑制心室增大。处理方案如图3A所示。治疗前和治疗后的MRI扫描用于阐明表型的进展。图3B/C是正常(B)或脑积水(C)动物的代表性例子，每次治疗的P7扫描体积和P15扫描体积相匹配，可以显示心室生长和药物或载体的效果。图3D为汇总数据，其中每个点代表单个动物从P7到P15的心室容积变化(ΔVV)。尽管存在一些表型变异，但大多数脑积水药物治疗的动物的心室容积从P7增加到P15，并且这种增加通过SGK1抑制剂SI113治疗显着减弱。另外，SI113对正常动物的心室容积没有影响。除了心室肿大外，与正常窝鼠相比，大鼠还会出现明显的大头畸形[20]。用于MRI研究的相同脑积水动物在P15处测量了颅骨尺寸，这些值报告在图3E中。在耳间和垂直头部尺寸方面，SI113治疗减小了脑积水动物的颅骨尺寸。野生型动物的头部尺寸未因药物治疗而发生变化，这与我们之前在TRPV4拮抗剂治疗研究中的发现相似。此外，尽管脑积水动物的体重通常低于正常窝鼠，但药物治疗与药物治疗相比，并没有显著改变体重(数据未显示)。

　　图3

　　

　　SI113治疗可改善遗传大鼠模型(Tmem67P394L)中的脑积水。正常和脑积水(Tmem67.P394L)幼崽从P7至P15，每天通过腹腔注射药体(DMSO)或SI113 (8 mg/kg BW)，如图a的治疗示意图所示。图B和C分别代表匹配的正常和脑积水动物。这两张图显示了P7起始心室容积相似的代表性动物，比较了P15时载药或药物治疗对心室容积的平均影响。图中所示动物的MRI扫描的冠状面切片在每个图的旁边显示。图D总结了队列中所有动物的心室容积(VV)从P7到P15的变化，表明药物治疗有效地阻止了患病动物心室增大的进展，而对正常动物的心室容积没有影响。E表示SI113治疗对脑积水动物颅骨尺寸的影响。数据在图D和e中以mean±sem表示。Veh=vehicle, DMSO;si=si113;VV=心室容积;Ns=不显著;D中柱状图上的数字表示所列比较的p值;****=p < 0.0001

　　使用治疗组动物侧脑室脉络膜丛裂解液(图3)，我们首先使用RT-PCR证实Sgk1和Trpv4表达(如图4A所示)。接下来，使用定量PCR来确定Trpv4和Sgk1基因表达的潜在变化，这些变化可能被脑积水或SI113治疗所修饰(图4B, C)。有趣的是，没有任何变化达到显著阈值，即与正常、未治疗的情况相比，测量的任何一种基因在任何方向上都没有发生两倍的变化。

　　图4

　　

　　Trpv4和Sgk1mRNA在大鼠脉络膜丛中的表达。(A) RT-PCR产物琼脂糖凝胶显示大鼠脉络膜丛中存在Sgk1和Trpv4。用Trpv4和Sgk1引物对正常和突变(P394L)脉络膜丛裂解物进行SI113处理和不处理(n=3个生物重复，技术重复)的qRT-PCR分析。虽然有统计学上的显著差异，但没有任何基因显示出与正常的、未经治疗的动物相比有超过两倍的变化。所有图表中的数据均以平均值±sem表示。TRPV4=瞬时受体电位香草素4;血清/糖皮质激素调节激酶-1=SGK1。引物信息见表1

　　我们假设，尽管基因表达没有明显变化，但可能由于脑积水和/或药物治疗，SGK1和TRPV4的丰度和/或磷酸化以及SGK1的一些下游靶点会发生变化。为了评估这一点，我们对侧脑室脉络膜丛裂解物进行了免疫印迹检测，以确定TRPV4、SGK1、p-SGK1 (t256)、p-NEDD4-2 (s448)和p-NDRG1 (t356)的丰度。我们发现，在脑积水或药物治疗的反应中，之前鉴定的CPe异构体和糖基化产物的总TRPV4丰度没有变化(图5A)，这与我们之前的TRPV4拮抗剂治疗研究的结果一致[20]。此外，p-SGK1 (t256)与SGK1的比值(SGK1活性的表征)也没有因脑积水而改变(图5B)。然而，在正常和脑积水动物中，SI113治疗确实显著降低了SGK1的磷酸化水平(图5B);在某些情况下，这是无法检测到的水平。在SI113处理的脑积水动物中，下游SGK1靶点p-NDRG1和p-NEDD4-2的磷酸化也同样减少(图5C)，进一步表明SI113作为SGK1抑制剂的作用。

　　图5

　　

　　si113介导的脑积水(P394L)大鼠脉络膜丛中TRPV4、p-SGK1和SGK1下游靶点丰度的变化。在未治疗或SI113治疗的正常和脑积水动物中，侧脑室脉络膜丛裂解物的代表性免疫印迹检测TRPV4。波段强度归一化为Ponceau-S，图中表示TRPV4与总蛋白的比值。在技术重复和n=3个生物重复中对裂解物进行印迹。B正常和脑积水动物SI113处理或未处理组织中SGK1和p-SGK1 (t256)的代表性免疫印迹。条带强度归一化为Ponceau-S表示每条通道的总蛋白负载，图中表示样品中p-SGK1与总SGK1的比值。在技术重复和n=4个生物重复中对裂解物进行印迹。C正常和脑积水动物侧脑室脉络膜丛裂解物中SGK1、p-NEDD4-2和p-NDRG1下游靶点的代表性免疫印迹，未处理或用SI113处理。波段强度归一化到Ponceau-S，图形表示感兴趣的蛋白质与总蛋白质的比例。在技术重复和n=2个生物重复中对裂解物进行印迹。所有图表中的数据均以平均值±sem表示。显著性值显示在图形上，并通过GraphPad Prism 8.0中的学生unpaired t检验确定

　　下载原文档：https://link.springer.com/content/pdf/10.1186/s12987-023-00461-0.pdf

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